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Chirale Chromatographie und chirale HPLC-Säulen
Die chirale Chromatographie ermöglicht die Trennung von Enantiomeren – Molekülen, die sich wie Bild und Spiegelbild verhalten und nicht zur Deckung gebracht werden können. Besonders in der pharmazeutischen Forschung, Wirkstoffentwicklung, Qualitätskontrolle und präparativen Aufreinigung spielt die Enantiomerentrennung mittels HPLC und SFC eine wichtige Rolle.
Entscheidend für eine erfolgreiche chirale Trennung ist die Auswahl der passenden chiralen stationären Phase (CSP, Chiral Stationary Phase). Anders als bei vielen klassischen chromatographischen Trennungen lässt sich die geeignete Selektivität jedoch nur eingeschränkt aus der Struktur des Analyten vorhersagen. Die Auswahl der richtigen chiralen Säule ist deshalb häufig der entscheidende Schritt der Methodenentwicklung.
MZ-Analysentechnik bietet eines der umfangreichsten Sortimente an chiralen HPLC- und SFC-Säulen unterschiedlicher Hersteller und Selektorklassen. Als offizieller Partner von Chiral Technologies / Daicel, dem weltweit führenden Spezialisten für chirale Chromatographie, verfügen wir darüber hinaus über direkten Zugang zu einem besonders breiten Portfolio chiraler Phasen und umfangreichem Applikationswissen.
Sie wissen noch nicht, welche chirale Säule zu Ihrer Verbindung passt? Kontaktieren Sie uns mit Ihrer Trennaufgabe. Wir unterstützen Sie bei der Säulenauswahl, Applikationsrecherche und Suche nach geeigneten Alternativen.
Technische Daten
Grundlagen der chiralen Chromatographie
Welche Möglichkeiten gibt es Enantiomere via HPLC zu trennen?
- Der mobilen Phase wird "Chiralität zugeführt" - z. B. durch Zusatz eines chiralen Reagens. Dadurch entstehen zwischen den Probemolekülen und den Molekülen des chiralen Reagens diastereomere Komplexe, die unterschiedlich schnell durch die Trennsäule wandern. Die stationäre Phase bleibt dabei unverändert, d. h. sie ist achiral.
- Die Enantiomere werden reversibel mit einer geeigneten chiralen Verbindung derivatisiert, d. h. chemisch umgesetzt. Dadurch entstehen Diastereomere, die sich auf herkömmlichen HPLC Phasen trennen lassen. Nach erfolgter Trennung werden die Derivate wieder gespalten, wobei darauf zu achten ist, dass unter den Reaktionsbedingungen keine Racemisierung auftritt.
- Als stationäre Phase wird eine speziell modifizierte, chirale Phase verwendet. Die mobile Phase bleibt unverändert. Die zu trennenden Enantiomere treten unterschiedlich stark mit der chiralen stationären Phase in Wechselwirkung und verlassen somit zu unterschiedlichen Zeiten die Trennsäule.
Die letzte der genannten Möglichkeiten (Nummer 3) wird im Allgemeinen als "chirale HPLC" bezeichnet. Sie ist von den drei Varianten am einfachsten durchzuführen. Aufgrund der großen Vielfalt verfügbarer chiraler Selektoren bestehen für viele Substanzklassen sehr gute Chancen, eine geeignete stationäre Phase für die Enantiomerentrennung zu finden.
Welche stationären Phasen werden für die chirale HPLC verwendet?
Die stationären Phasen für die chirale HPLC (engl.: Chiral Stationary Phases - CSPs) basieren mehrheitlich auf Silika-Gel. Um Enantiomere zu trennen wird dieses mit sogenannten chiralen Selektoren modifiziert. Bis heute wurden eine Vielzahl von solchen Verbindungen entwickelt, wodurch die Auswahl an erhältlichen Phasen enorm groß ist.
Folgende Verbindungsklassen werden hauptsächlich als chirale Selektoren verwendet:
- Sogenannte "Bürstenphasen" - Einfache chirale Moleküle, die ähnlich der Alkylketten bei der RP-HPLC, auf die Oberfläche des Silica-Gels gebunden sind, z. B. Dinitrobenzoylphenylglycin
- Helicale Polymere, z. B. Cellulose– oder Amylosederivate
- Chirale Käfigverbindungen, z. B. Cyclodextrine oder Kronenether
- Proteine, z. B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Pepsin
- Ligandenaustauschphasen, z. B. Aminosäure-Kupfer-Komplexe
Am meisten werden modifizierte Cellulose– oder Amylosederivate verwendet, weil mit diesen Phasen im Vergleich zu anderen chiralen Selektoren eine sehr großes Spektrum an Enantiomeren getrennt werden kann.
Immobilisierte oder beschichtete chirale Phasen – was ist der Unterschied?
Dafür gibt es mehrere Möglichkeiten. Einige der chiralen Selektoren können kovalent an das Silica-Gel zu gebunden werden. Für manche der chiralen Selektoren ist dies aber nicht möglich. So werden z. B. Polysaccharidderivate in einem speziellen Verfahren entweder an das Silica-Gel chemisch immobilisiert ("Immobilized CSPs") oder darauf beschichtet ("Coated CSPs"). Der Unterschied zwischen den "Immobilized CSPs" und den "Coated CSPs" besteht darin, dass die immobilisierten Phasen gegenüber organischen Lösungsmittel weitaus robuster sind. Für die Coated CSPs sind eine Reihe von Lösungsmitteln nicht erlaubt, da diese die chirale stationäre Phase mit der Zeit unbrauchbar machen. Für die "Immobilized CSPs" ist das nicht der Fall, was die Methodenentwicklung für die Trennung von Enantiomeren vereinfacht.
Welche mobile Phasen können für chirale HPLC-Trennungen verwendet werden?
Das ist abhängig von der stationären Phase. Wie oben bereits erwähnt gibt es chirale Phasen, die mit sehr vielen organischen Lösungsmitteln kompatibel sind und wieder andere bei denen die Anzahl an möglichen Eluenten sehr limitiert ist. Welche Eluenten verwendet werden dürfen, findet man oft in den mitgelieferten Säuleninfo- bzw. "Care&Maintanance"-Sheets der Hersteller. Falls Unsicherheit besteht, sollte beim jeweiligen Hersteller oder Händler nachgefragt werden.
Die richtige chirale Säule
Die Auswahl einer geeigneten chiralen HPLC-Säule unterscheidet sich deutlich von der Auswahl klassischer Reversed-Phase-Säulen. Während sich beispielsweise die Retention auf einer C18-Phase häufig anhand der Stoffeigenschaften abschätzen lässt, ist die Enantioselektivität einer chiralen stationären Phase (CSP) wesentlich schwieriger vorherzusagen. Bereits kleine Änderungen am Selektor oder an der mobilen Phase können darüber entscheiden, ob zwei Enantiomere getrennt werden.
Für eine erfolgreiche Methodenentwicklung sind daher vor allem die Struktur des Analyten, die Wahl des chiralen Selektors und der chromatographische Modus entscheidend. Aufgrund der großen Zahl verfügbarer CSPs ist eine systematische Vorauswahl meist sinnvoller, als einzelne chirale Säulen nacheinander auszuprobieren.
Auswahl nach Analyt und chiraler Selektivität
Die Wechselwirkungen zwischen Analyt und chiraler stationärer Phase können unter anderem auf Wasserstoffbrückenbindungen, π-π-Wechselwirkungen, Dipol-Wechselwirkungen, ionischen Wechselwirkungen und sterischen Effekten beruhen. Funktionelle Gruppen, Ladung und räumliche Struktur des Analyten beeinflussen daher die Enantioselektivität.
Für viele Verbindungen sind Polysaccharidphasen ein sinnvoller Ausgangspunkt für das Screening. Daneben stehen unter anderem proteinbasierte, zwitterionische, Kronenether-, Ligandenaustausch- und weitere spezialisierte chirale Phasen zur Verfügung. Insbesondere für bestimmte Substanzklassen können diese Selektoren gegenüber Polysaccharidphasen Vorteile bieten.
Eine Literatur- und Applikationsrecherche kann die Auswahl erheblich vereinfachen. Existieren bereits Trennungen für die betreffende Verbindung oder strukturell ähnliche Analyten, lassen sich daraus häufig geeignete Selektoren und Startbedingungen ableiten.
Immobilisierte oder beschichtete chirale Phasen?
Bei polysaccharidbasierten CSPs stehen sowohl beschichtete (coated) als auch immobilisierte Phasen zur Verfügung. Beschichtete Phasen können eine sehr hohe Enantioselektivität bieten, unterliegen jedoch Einschränkungen bei der Wahl der Lösungsmittel. Bei immobilisierten Phasen ist der chirale Selektor chemisch an das Trägermaterial gebunden. Dadurch steht eine größere Auswahl an organischen Lösungsmitteln zur Verfügung, was insbesondere bei schwierigen Trennproblemen zusätzliche Möglichkeiten zur Optimierung der Selektivität eröffnet.
Welche Variante die bessere Trennung liefert, lässt sich nicht generell vorhersagen. Immobilisierte Phasen sind daher nicht grundsätzlich ein Ersatz für die entsprechenden beschichteten Phasen – beide Varianten können unterschiedliche Selektivitäten zeigen.
Wahl des chromatographischen Modus
Viele chirale Säulen können je nach Phase unter Normalphasen-, Reversed-Phase- oder Polar-Organic-Bedingungen eingesetzt werden. Darüber hinaus spielt die chirale Chromatographie eine wichtige Rolle in der SFC (Supercritical Fluid Chromatography).
Der geeignete Modus hängt vom Analyten, der stationären Phase und den Anforderungen der Methode ab. Ein Wechsel der mobilen Phase kann die chirale Erkennung erheblich beeinflussen und ist deshalb ein wichtiger Parameter bei der Methodenoptimierung.
Screening und Methodenentwicklung
Ist für einen Analyten noch keine geeignete chirale Phase bekannt, empfiehlt sich ein systematisches Säulenscreening. Statt möglichst viele ähnliche CSPs zu testen, werden dabei gezielt Phasen mit unterschiedlichen Selektivitäten ausgewählt. Nach Identifikation einer geeigneten Phase können mobile Phase, Additive, Temperatur, Flussrate und weitere chromatographische Parameter optimiert werden.
MZ-Analysentechnik bietet eines der umfangreichsten Sortimente chiraler HPLC-, UHPLC- und SFC-Säulen verschiedener Hersteller und ist Partner von Daicel / Chiral Technologies, dem weltweit führenden Hersteller chiraler Chromatographiesäulen. Dadurch können wir bei der Säulenauswahl sowohl auf das breite Daicel-Portfolio als auch auf alternative Selektoren anderer Hersteller zurückgreifen.
Sie suchen eine chirale Säule für einen bestimmten Analyten? Senden Sie uns nach Möglichkeit den Substanznamen, die CAS-Nummer oder Strukturformel sowie Informationen zu bereits getesteten Säulen und chromatographischen Bedingungen. Wir unterstützen Sie bei der Recherche vorhandener Applikationen und bei der Auswahl geeigneter chiraler Phasen für Ihre Trennaufgabe.
Hersteller und Säulen für die chirale Chromatographie
Daicel™ - Chiral Technologies™
Daicel / Chiral Technologies zählt weltweit zu den führenden Spezialisten für die chirale Chromatographie und bietet eines der umfangreichsten Portfolios chiraler stationärer Phasen. MZ-Analysentechnik ist offizieller Partner von Daicel und unterstützt Anwender bei der Auswahl geeigneter Phasen und Säulendimensionen sowie bei technischen Fragestellungen zur chiralen Methodenentwicklung.
Zum Portfolio gehören unter anderem die bekannten Chiralpak®- und Chiralcel®-Säulen mit immobilisierten und beschichteten Polysaccharidphasen sowie Crownpak® und weitere Spezialphasen. Damit stehen Selektoren für ein sehr breites Spektrum chiraler Verbindungen und unterschiedliche chromatographische Modi zur Verfügung.
Zu den verfügbaren Selektorklassen gehören Polysaccharid-, zwitterionische und proteinbasierte CSPs sowie Kronenether, Anionenaustausch- und Ligandenaustauschphasen.
Nouryon™ - Kromasil
Nouryon bietet mit CelluCoat™ und AmyCoat™ zwei besonders robuste chirale stationäre Phasen an. Für CelluCoat™ ist der chirale Selektor Cellulosetris-(3,5-dimethyl-phenylcarbamat); für AmyCoat™ Amylosetris-(3,5-dimethyl-phenylcarbamat). Die stationären Phasen halten Drücken bis zu 400 bar stand und sind mit vielen organischen Lösungsmitteln kompatibel, ohne dass die Performance der Säulen beeinträchtigt wird. Kromasil® CelluCoat™ bzw. AmyCoat™ sind in Partikelgrößen von 3, 5 oder 10 µm erhältlich, wobei das 10 µm Material auch als Bulk-Material verfügbar ist.
Macherey-Nagel™
Macherey-Nagel ist Hersteller von mehreren chiralen stationären Phasen für unterschiedliche Anwendungsbereiche. Des Weiteren sind chirale TLC-Plates verfügbar.
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Nucleodex β-OH | Underivatized β-Cyclodextrin |
| Nucleodex β-PM | Permethylated β-Cyclodextrin |
| Nucleodex α-PM | Permethylated α-Cyclodextrin |
| Nucleocel Delta | Cellulose-tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) |
| Resolvosil BSA-7 | Bovine serum albumin (BSA) |
| Nucleosil CHIRAL-1 | L-Hydroxyproline-Cu2+-complex |
| Nucleosil CHIRAL-2 | N-(3,5-dinitrobenzoyl)-D-phenylglycin |
| Nucleosil CHIRAL-3 | N-(3,5-dinitrobenzoyl)-L-phenylglycin |
Supelco™
Supelco (Merck™ früher Sigma-Aldrich™) ist Hersteller einiger spezieller HPLC-Säulen für die Enantiomerentrennung, die ursprünglich von der Firma Astec in Zusammenarbeit mit Prof. D. Armstrong von der "University of Texas at Arlington" entwickelt wurden. Seit 2006 ist Astec Teil von Sigma-Aldrich, welches wiederum seit 2015 zur Merck KGaA gehört.
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Astec Chirobiotic® V (100 Å) Astec Chirobiotic® V2 (200 Å) | Vancomycin |
| Astec Chirobiotic® T (100 Å) Astec Chirobiotic® T2 (200 Å) | Teicoplanin |
| Astec Chirobiotic® R (100 Å) | Ristocetin |
| Astec Chirobiotic® TAG (100 Å) | Teicoplanin Aglycone |
| Astec (R,R) P-CAP™ Astec (S,S) P-CAP™ | Poly(trans-1,2-cyclohexanediyl-bis-acrylamide) |
| Astec (R,R) P-CAP™-DP Astec (S,S) P-CAP™-DP | Poly(trans-1,2-diphenyl-bis-acrylamide) |
| Astec CLC-L Astec CLC-D | Amino acid Cu(II)-complexes |
| Astec Cyclobond® I 2000 | β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 AC | Acetylated β-Cyclodextrin |
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Astec Cyclobond® I 2000 DM | 2,3-O-Dimethyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 DMP | 3,5-Dimethylphenyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 DMP | 2,6-Dinitro-4-fluoromethylphenyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 HP-RSP | R,S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 RSP | R,S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 SP | S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® II | γ-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® II AC | Acetylated γ-Cyclodextrin |
| Astec Cellulose DMP | Cellulosetris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) |
Shinwa Chemical Industries Ltd
Shinwa’s Bestseller Chromatographiesäule ist die Ultron ES-OVM Säule (Art. Nr. 401-102), die die Spezifikationen der United States Pharmacopoeia USP L57 erfüllt. Darüberhinaus sind weitere Säulen für die chirale Chromatographie erhältlich.
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Ultron ES-OVM | Ovomucoid |
| Ultron ES-OVM-C | Ovomucoid |
| Ultron ES-Pepsin | Pepsin |
| Ultron ES-BSA | Bovine serum albumin |
| Ultron ES-CD | β-Cyclodextrin |
| Ultron ES-PhCD | β-Cyclodextrin derivative |
Sumika Chemicals Analysis Service Ltd. (SCAS)
Sumika™ bietet Spezialsäulen für chirale Trennungen mittels HPLC.
| Sumichiral | Chiraler Selektor | Sumichiral | Chiraler Selektor |
| OA-2000 | (R)-Phenylglycine | OA-2000S | (S)-Phenylglycine |
| OA-2000-I | (R)-Phenylglycine | OA-2000S-I | (S)-Phenylglycine |
| OA-2500 | (R)-1-Naphtylglycine | OA-2500S | (S)-1-Naphtylglycine |
| OA-2500-I | (R)-1-Naphtylglycine | OA-2500S-I | (S)-1-Naphtylglycine |
| OA-3100 | (S)-Valine | OA-3100R | (R)-Valine |
| OA-3200 | (S)-tert-Leucine | OA-3200R | (R)-tert-Leucine |
| OA-3300 | (R)-Phenylglycine | OA-3300S | (S)-Phenylglycine |
| OA-4000 | (S)-Valine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4000R | (R)-Valine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4100 | (S)-Valine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4100R | (R)-Valine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4400 | (S)-Proline (S)-1-(α-naphthyl)ethylamine | OA-4400R | (R)-Proline (R)-1-(α-naphthyl)ethylamine |
| OA-4500 | (S)-Proline (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4500R | (R)-Proline (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4600 | (S)-tert-Leucine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4600R | (R)-tert-Leucine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4700 | (S)-tert-Leucine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4700R | (R)-tert-Leucine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4800 | (S)-Indoline-2-carboxylic acid (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | - | - |
| OA-4900 | (S)-Indoline-2-carboxylic acid (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | - | - |
| OA-5000 | (D)-Penicillamine | OA-5000L | (L)-Penicillamine |
| OA-6000 | (L)-Tartaric acid (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-6000R | (D)-Tartaric acid (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-6100 | (L)-Tartaric acid, (S)-Valine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-6100R | (D)-Tartaric acid, (R)-Valine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-7000 | β-Cyclodextrin | - | - |
| OA-7100 | β-Cyclodextrin | - | - |
| OA-7500 | Methyl-β-cyclodexitrin | - | - |
| OA-7600 | Methyl-α-cyclodexitrin | - | - |
| OA-7700 | Acetyl-β-cyclodexitrin | - | - |
| OA-8000 | Chiral pseudo-crown ether | - | - |
Shodex™
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| ORpak CDBS-453 | β-Cyclodextrin derivative |
| ORpak CRX-853 | L-Amino acid derivative |
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