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Chirale Chromatographie
Die chirale Chromatographie ist ein Verfahren um Enantiomerengemische zu trennen. Enantiomere sind Moleküle, bei denen sich Bild und Spiegelbild nicht zur Deckung bringen lassen. Enantiomere unterscheiden sich in ihren Eigenschaften lediglich in der Drehrichtung von linear polarisiertem Licht. In allen anderen chemischen und physikalischen Eigenschaften zeigen sie keinen Unterschied. Aus diesem Grund lassen sich Enantiomere auch nicht mit "konventionellen" HPLC Techniken trennen.
Das Hauptanwendungsgebiet liegt in der pharmazeutischen Forschung und Industrie um biologisch aktive Substanzen und Arzneistoffe enantiomerenrein zu gewinnen. Dies ist von außerordentlicher Wichtigkeit, da Enantiomere völlig unterschiedliche pharmakologische Wirkung aufweisen können. Deshalb ist es für die Arzneimittelentwicklung nötig, dass die Zielverbindungen enantiomerenrein vorliegen und getrennt auf ihre Wirksamkeit und Toxizität getestet werden.
Technische Daten
Grundlagen zur chiralen Chromatographie
Welche Möglichkeiten gibt es Enantiomere via HPLC zu trennen?
- Der mobilen Phase wird "Chiralität zugeführt" - z. B. durch Zusatz eines chiralen Reagens. Dadurch entstehen zwischen den Probemolekülen und den Molekülen des chiralen Reagens diastereomere Komplexe, die unterschiedlich schnell durch die Trennsäule wandern. Die stationäre Phase bleibt dabei unverändert, d. h. sie ist achiral.
- Die Enantiomere werden reversibel mit einer geeigneten chiralen Verbindung derivatisiert, d. h. chemisch umgesetzt. Dadurch entstehen Diastereomere, die sich auf herkömmlichen HPLC Phasen trennen lassen. Nach erfolgter Trennung werden die Derivate wieder gespalten, wobei darauf zu achten ist, dass unter den Reaktionsbedingungen keine Racemisierung auftritt.
- Als stationäre Phase wird eine speziell modifizierte, chirale Phase verwendet. Die mobile Phase bleibt unverändert. Die zu trennenden Enantiomere treten unterschiedlich stark mit der chiralen stationären Phase in Wechselwirkung und verlassen somit zu unterschiedlichen Zeiten die Trennsäule.
Die letzte der genannten Möglichkeiten (Nummer 3) wird im Allgemeinen als "chirale HPLC" bezeichnet. Sie ist von den drei Varianten am einfachsten durchzuführen und die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Trennung ist - aufgrund der Vielzahl an erhältlichen stationären Phasen - fast garantiert.
Welche stationären Phasen werden für die chirale HPLC verwendet?
Die stationären Phasen für die chirale HPLC (engl.: Chiral Stationary Phases - CSPs) basieren mehrheitlich auf Silika-Gel. Um Enantiomere zu trennen wird dieses mit sogenannten chiralen Selektoren modifiziert. Bis heute wurden eine Vielzahl von solchen Verbindungen entwickelt, wodurch die Auswahl an erhältlichen Phasen enorm groß ist.
Folgende Verbindungsklassen werden hauptsächlich als chirale Selektoren verwendet:
- Sogenannte "Bürstenphasen" - Einfache chirale Moleküle, die ähnlich der Alkylketten bei der RP-HPLC, auf die Oberfläche des Silica-Gels gebunden sind, z. B. Dinitrobenzoylphenylglycin
- Helicale Polymere, z. B. Cellulose– oder Amylosederivate
- Chirale Käfigverbindungen, z. B. Cyclodextrine oder Kronenether
- Proteine, z. B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Pepsin
- Ligandenaustauschphasen, z. B. Aminosäure-Kupfer-Komplexe
Am meisten werden modifizierte Cellulose– oder Amylosederivate verwendet, weil mit diesen Phasen im Vergleich zu anderen chiralen Selektoren eine sehr großes Spektrum an Enantiomeren getrennt werden kann.
Wie werden die chiralen Selektoren an das Silica-Gel gebunden?
Dafür gibt es mehrere Möglichkeiten. Einige der chiralen Selektoren können kovalent an das Silica-Gel zu gebunden werden. Für manche der chiralen Selektoren ist dies aber nicht möglich. So werden z. B. Polysaccharidderivate in einem speziellen Verfahren entweder an das Silica-Gel chemisch immobilisiert ("Immobilized CSPs") oder darauf beschichtet ("Coated CSPs"). Der Unterschied zwischen den "Immobilized CSPs" und den "Coated CSPs" besteht darin, dass die immobilisierten Phasen gegenüber organischen Lösungsmittel weitaus robuster sind. Für die Coated CSPs sind eine Reihe von Lösungsmitteln nicht erlaubt, da diese die chirale stationäre Phase mit der Zeit unbrauchbar machen. Für die "Immobilized CSPs" ist das nicht der Fall, was die Methodenentwicklung für die Trennung von Enantiomeren vereinfacht.
Welche mobile Phasen können für chirale Trennungen verwendet werden?
Das ist abhängig von der stationären Phase. Wie oben bereits erwähnt gibt es chirale Phasen, die mit sehr vielen organischen Lösungsmitteln kompatibel sind und wieder andere bei denen die Anzahl an möglichen Eluenten sehr limitiert ist. Welche Eluenten verwendet werden dürfen, findet man oft in den mitgelieferten Säuleninfo- bzw. "Care&Maintanance"-Sheets der Hersteller. Falls Unsicherheit besteht, sollte beim jeweiligen Hersteller oder Händler nachgefragt werden.
Weitere Tipps und Informationen zur chiralen Chromatographie
Chirale Trennungen werden in der Regel isokratisch durchgeführt. Wie bei anderen chromatographischen Verfahren auch, ist die Auflösung für ein bestimmtes Analytpaar stark von der Selektivität der stationären Phase abhängig. Zwei weitere wichtige Parameter für die Methodenentwicklung sind die mobile Phase und die Temperatur. Bei chiralen Trennungen ist es oft der Fall, dass mit sinkender Temperatur die Auflösung steigt.
Hersteller und Säulen für die chirale Chromatographie
Daicel™ - Chiral Technologies™
Daicel ist der führende Hersteller mit der größten Auswahl an chiralen stationären Phasen. Die erhältlichen Partikelgrößen reichen von sub-2 µm für UHPLC Trennungen bis 20 µm für die MPLC. Chirale TLC-Plates für die Dünnschichtchromatographie sind ebenfalls von Daicel™ erhältlich.
Folgende Arten von chiralen stationären Phasen (CSPs) bietet Daicel™ an:
- Polysaccharid basierte CSPs
- Zwitterionische CSPs
- Protein-basierte CSPs
- Anionaustausch CSPs
- Kronenether und Aminosäure-Metall-Komplexe
Nouryon™ - Kromasil
Kromasil bietet mit CelluCoat™ und AmyCoat™ zwei besonders robuste chirale stationäre Phasen an. Für CelluCoat™ ist der chirale Selektor Cellulosetris-(3,5-dimethyl-phenylcarbamat); für AmyCoat™ Amylosetris-(3,5-dimethyl-phenylcarbamat). Die stationären Phasen halten Drücken bis zu 400 bar stand und sind mit vielen organischen Lösungsmitteln kompatibel, ohne dass die Performance der Säulen beeinträchtigt wird. Kromasil® CelluCoat™ bzw. AmyCoat™ sind in Partikelgrößen von 3, 5 oder 10 µm erhältlich, wobei das 10 µm Material auch als Bulk-Material verfügbar ist.
Macherey-Nagel™
Macherey-Nagel ist Hersteller von mehreren chiralen stationären Phasen für unterschiedliche Anwendungsbereiche. Des Weiteren sind chirale TLC-Plates verfügbar.
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Nucleodex β-OH | Underivatized β-Cyclodextrin |
| Nucleodex β-PM | Permethylated β-Cyclodextrin |
| Nucleodex α-PM | Permethylated α-Cyclodextrin |
| Nucleocel Delta | Cellulose-tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) |
| Resolvosil BSA-7 | Bovine serum albumin (BSA) |
| Nucleosil CHIRAL-1 | L-Hydroxyproline-Cu2+-complex |
| Nucleosil CHIRAL-2 | N-(3,5-dinitrobenzoyl)-D-phenylglycin |
| Nucleosil CHIRAL-3 | N-(3,5-dinitrobenzoyl)-L-phenylglycin |
Supelco™
Supelco (Merck™ früher Sigma-Aldrich™) ist Hersteller einiger spezieller HPLC-Säulen für die Enantiomerentrennung, die ursprünglich von der Firma Astec in Zusammenarbeit mit Prof. D. Armstrong von der "University of Texas at Arlington" entwickelt wurden. Seit 2006 ist Astec Teil von Sigma-Aldrich, welches wiederum seit 2015 zur Merck KGaA gehört.
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Astec Chirobiotic® V (100 Å) Astec Chirobiotic® V2 (200 Å) | Vancomycin |
| Astec Chirobiotic® T (100 Å) Astec Chirobiotic® T2 (200 Å) | Teicoplanin |
| Astec Chirobiotic® R (100 Å) | Ristocetin |
| Astec Chirobiotic® TAG (100 Å) | Teicoplanin Aglycone |
| Astec (R,R) P-CAP™ Astec (S,S) P-CAP™ | Poly(trans-1,2-cyclohexanediyl-bis-acrylamide) |
| Astec (R,R) P-CAP™-DP Astec (S,S) P-CAP™-DP | Poly(trans-1,2-diphenyl-bis-acrylamide) |
| Astec CLC-L Astec CLC-D | Amino acid Cu(II)-complexes |
| Astec Cyclobond® I 2000 | β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 AC | Acetylated β-Cyclodextrin |
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Astec Cyclobond® I 2000 DM | 2,3-O-Dimethyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 DMP | 3,5-Dimethylphenyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 DMP | 2,6-Dinitro-4-fluoromethylphenyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 HP-RSP | R,S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 RSP | R,S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® I 2000 SP | S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® II | γ-Cyclodextrin |
| Astec Cyclobond® II AC | Acetylated γ-Cyclodextrin |
| Astec Cellulose DMP | Cellulosetris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) |
Shinwa Chemical Industries Ltd
Shinwa’s Bestseller Chromatographiesäule ist die Ultron ES-OVM Säule (Art. Nr. 401-102), die die Spezifikationen der United States Pharmacopoeia USP L57 erfüllt. Darüberhinaus sind weitere Säulen für die chirale Chromatographie erhältlich.
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| Ultron ES-OVM | Ovomucoid |
| Ultron ES-OVM-C | Ovomucoid |
| Ultron ES-Pepsin | Pepsin |
| Ultron ES-BSA | Bovine serum albumin |
| Ultron ES-CD | β-Cyclodextrin |
| Ultron ES-PhCD | β-Cyclodextrin derivative |
Sumika Chemicals Analysis Service Ltd. (SCAS)
Sumika™ bietet Spezialsäulen für chirale Trennungen mittels HPLC.
| Sumichiral | Chiraler Selektor | Sumichiral | Chiraler Selektor |
| OA-2000 | (R)-Phenylglycine | OA-2000S | (S)-Phenylglycine |
| OA-2000-I | (R)-Phenylglycine | OA-2000S-I | (S)-Phenylglycine |
| OA-2500 | (R)-1-Naphtylglycine | OA-2500S | (S)-1-Naphtylglycine |
| OA-2500-I | (R)-1-Naphtylglycine | OA-2500S-I | (S)-1-Naphtylglycine |
| OA-3100 | (S)-Valine | OA-3100R | (R)-Valine |
| OA-3200 | (S)-tert-Leucine | OA-3200R | (R)-tert-Leucine |
| OA-3300 | (R)-Phenylglycine | OA-3300S | (S)-Phenylglycine |
| OA-4000 | (S)-Valine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4000R | (R)-Valine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4100 | (S)-Valine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4100R | (R)-Valine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4400 | (S)-Proline (S)-1-(α-naphthyl)ethylamine | OA-4400R | (R)-Proline (R)-1-(α-naphthyl)ethylamine |
| OA-4500 | (S)-Proline (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4500R | (R)-Proline (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4600 | (S)-tert-Leucine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4600R | (R)-tert-Leucine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4700 | (S)-tert-Leucine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-4700R | (R)-tert-Leucine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-4800 | (S)-Indoline-2-carboxylic acid (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | - | - |
| OA-4900 | (S)-Indoline-2-carboxylic acid (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | - | - |
| OA-5000 | (D)-Penicillamine | OA-5000L | (L)-Penicillamine |
| OA-6000 | (L)-Tartaric acid (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-6000R | (D)-Tartaric acid (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-6100 | (L)-Tartaric acid, (S)-Valine (S)-1-(α-Naphthyl)ethylamine | OA-6100R | (D)-Tartaric acid, (R)-Valine (R)-1-(α-Naphthyl)ethylamine |
| OA-7000 | β-Cyclodextrin | - | - |
| OA-7100 | β-Cyclodextrin | - | - |
| OA-7500 | Methyl-β-cyclodexitrin | - | - |
| OA-7600 | Methyl-α-cyclodexitrin | - | - |
| OA-7700 | Acetyl-β-cyclodexitrin | - | - |
| OA-8000 | Chiral pseudo-crown ether | - | - |
Shodex™
| HPLC-Säule | Chiraler Selektor |
| ORpak CDBS-453 | β-Cyclodextrin derivative |
| ORpak CRX-853 | L-Amino acid derivative |
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