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Methodenentwicklung

Die chromatographische Methodenentwicklung verfolgt das Ziel eine bestimmte Anzahl von Analyten in möglichst kurzer Zeit und bestmöglicher Auflösung zu trennen. Gleichzeitig sollen die Methoden reproduzierbar und robust sein, damit zu unterschiedlichen Zeiten, an verschiedenen Orten identische Ergebnisse erhalten werden können.

Die Auflösung (Rs) einer Trennung wird durch die folgende Gleichung beschrieben:

Die Auflösung wird demnach durch die Effizienz N, die Selektivität α und die Retention k beeinflusst.

Die Effizienz N einer Säule ist u.A. von deren Länge, der Partikelgröße und der Partikelform abhängig. Sie wird durch die theoretische Bodenzahl einer Säule beschrieben.

Als Beispiel: Bei Verdoppelung der Bodenzahl (entweder durch doppelte Säulenlänge oder Verkleinerung des Partikeldurchmessers) erhöht sich die Auflösung um den Faktor Wurzel 2, d.h. lediglich um etwa 40%. Dabei erhöht sich jedoch die Analysendauer und/oder der Rückdruck erheblich. Zu bedenken ist auch, dass bei Halbierung des Partikeldurchmessers sich der Rückdruck vervierfacht.

Die Selektivität α wird hauptsächlich beeinflusst von der Art der stationären Phase und der mobilen Phase.

Die Retention k kann ebenfalls durch die Art der stationären Phase und durch die Elutionskraft der mobilen Phase beeinflusst werden.

Aus der graphischen Auftragung der Auflösung gegen die Effizienz, Selektivität und Retention lässt sich erkennen, dass die Auflösung einer Trennung am stärksten von der Selektivität beeinflusst wird.

Aus diesem Grund ist die Selektivität der stationären Phase einer der nützlichsten Parameter zur Einstellung der HPLC-Trennungsselektivität und somit zur Optimierung der Auflösung. Die Methoden lassen sich vor allem zwischen den Labors leichter reproduzieren, wenn die Selektivität bei Verwendung einfacher mobiler Phasen aus der stationären Phase stammt. Hat die stationäre Phase die passende Selektivität für das gegebene Trennproblem, so lässt sich bei der darauffolgenden Optimierung einiges an Arbeit sparen.

Über MZ-Analysentechnik GmbH erhalten Sie Zugriff auf nahezu das gesamte Spektrum an weltweit erhältlichen stationären Phasen, damit Sie für Ihre Analyse stets die richtige Säule parat haben. Gern helfen wir Ihnen bei der Auswahl Ihrer passenden Säule.

Die Schritte einer typischen Methodenentwicklung könnten folgendermaßen aussehen:

  1. Auswahl der Trenntechnik (RP, NP, HILIC, SEC, IEX,...)
  2. Auswahl der Säulendimension
  3. Auswahl der stationären Phase
  4. Auswahl der mobilen Phase
  5. Einstellung des pH-Wertes der mobilen Phase mit einem geeigneten Pufferreagenz (falls benötigt)
  6. Durchführung einiger isokratischen oder Gradientenläufe um grundlegende Parameter festzulegen
  7. Weitere Optimierung der Parameter, z.B. durch Variation
    • der Temperatur
    • des Puffer- oder Ionenpaarreagenz
    • der Flussgeschwindigkeit
    • des Gradienten
    • ...

Einige Hersteller stellen zum Thema Methodenentwicklung hilfreiche Literatur bereit, die es dem Anwender erleichtern für sein Trennproblem die optimalen Bedingungen zu finden. Sehen Sie sich dazu bitte untenstehende Broschüren an. Bei Fragen zum Thema Methodenentwicklung oder der Säulenauswahl stehen wir Ihnen gern zur Verfügung.

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