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Umkehrphase

Reversed-Phase Chromatographie

Reversed-Phase Chromatographie

Die Reversed-Phase oder Umkehrphasen Chromatographie ist die am häufigsten angewandte Methode der Flüssigchromatographie. Sie ist gekennzeichnet durch stationäre Phasen mit unpolaren Oberflächeneigenschaften und einer mobilen Phase bzw. Eluenten von polaren Charakter – genau entgegengesetzt zur Normalphasenchromatographie.

Die stationären Phasen

Die stationären Phasen

Als stationäre Phasen werden häufig oberflächenmodifizierte (C30, C18, C8, C4, C1, C6H5,...) Silika-Gele verwendet. Diese können vergleichsweise einfach und in großen Mengen hergestellt werden und besitzen eine außerordentliche mechanische und zum Teil auch chemische Stabilität und Reproduzierbarkeit.

Weitere Materialien, die als stationäre Phasen der Reversed Phase Chromatographie verwendet werden, sind:  

  • Hydrophobe Polymere, z. B. Styrol-Divinylbenzol-Copolymer (PS-DVB)
  • Modifizierte hydrophile Polymere, z. B. C18-modifizierter Polyvinylalkohol
  • Graphitierter Kohlenstoff, z. B. Hypercarb™
  • Modifizierte Metalloxidpartikel, z. B. mit Kohlenstoff ummantelte Zirconiumoxidpartikel

 

Oberflächenmodifizierung von Silika-Gel

Oberflächenmodifizierung von Silika-Gel

Bei der Modifizierung von Silika-Gel, werden die an der Oberfläche vorhandenen Silanole (freie Si-OH Gruppen) mit unpolaren Gruppen chemisch umgesetzt. Bei diesem Vorgang bleiben unvermeidbar immer freie Restsilanole übrig, da es aufgrund von sterischen Gründen nicht möglich ist alle Silanole zur Reaktion zu bringen. Diese Restsilanole führen dann mitunter zu ungewollten Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase, was - bei nicht angepassten Bedingungen - zu ungenügender Trennleistung, Adsorbtion oder Peaktailing führen kann.

Abbildung 1:  Schematische Darstellung der Silica-Modifizierung und des darauffolgenden End-Cappings.

Neben freien Silanolen können auch Verunreinigungen im Basiskieselgel, z. B. Metallionen, zu unerwünschten polaren Wechselwirkungen führen. Deshalb basieren heutzutage fast alle stationären Phasen auf hochreinem Silika-Gel („Type B Silica“).

Der einfachste Ansatz um den Anteil der Restsilanole zu minimieren ist das sogenannte End-Capping. Dabei werden die verbliebenen Restsilanole mit kleinen Alkylierungsreagenzien, wie z. B. Trimethylsilyl (TMS)-Gruppen umgesetzt. Neben dem Endcapping kommen auch noch andere Verfahren zum Einsatz, mit denen vorhandene Restsilanole abgeschirmt werden sollen. Ziel dabei ist immer, dass die Analyten nicht mit freien Silanolen in Kontakt kommen.

Worauf beruht die Trennung bei der Reversed-Phase Chromatographie?

Worauf beruht die Trennung bei der Reversed-Phase Chromatographie?

In der klassischen Reversed-Phase Chromatographie beruht der Trennmechanismus hauptsächlich auf der unterschiedlichen Verteilung der Analyten zwischen der stationären und der mobilen Phase. Dieses Phänomen lässt sich auch als eine Art Extraktion der Analyten zwischen stationärer und mobiler Phase verstehen. Das heißt ein unpolarer Analyt löst sich bevorzugt in der stationären Phase, hält sich dementsprechend bevorzugt dort auf und wird somit langsam von der Säule eluiert. Polare Verbindungen werden hingegen sehr zügig von der Trennsäule gespült, da diese sich bevorzugt in der mobilen Phase aufhalten.

Bei vernachlässigbar kleinen Anteilen von freien Restsilanolen tragen zur Trennung somit nur hydrophobe Wechselwirkungen (Van-der-Waals-Kräfte) bei. In Abhängigkeit von der Silika-Modifizierung können zusätzlich auch andere Wechselwirkungen zur Trennung mit beitragen, z. B. π-π-Interaktionen bei Phenyl-modifizierten stationären Phasen usw.

Welche Lösungsmittel werden als mobile Phasen verwendet?

Welche Lösungsmittel werden als mobile Phasen verwendet?

Die bei der Reversed-Phase Chromatographie verwendete mobile Phase enthält fast immer Wasser als Komponente mit der geringsten Elutionskraft, und ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, durch das die Elutionskraft der mobilen Phase erhöht wird. Dazu werden meistens Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran verwendet, die sich untereinander nicht allein in ihrer Elutionskraft unterscheiden, sondern auch in der Selektivität der Wechselwirkungen, die sie mit den Analyten und der stationären Phase eingehen.

Hersteller von Reversed-Phase HPLC-Säulen

Hersteller von Reversed-Phase HPLC-Säulen

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