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Zuckeranalytik

Analytik und Trennung von Sacchariden und Derivaten

Analytik und Trennung von Sacchariden und Derivaten

Eine effiziente und verlässliche Analytik von Lebensmitteln und deren Inhaltsstoffen hat in den letzten Jahren in zunehmenden Maße an Bedeutung gewonnen, da die Anforderungen an die Lebensmittelsicherheit und der verwendeten Rezepturen beständig gestiegen sind. Ein großer Bereich der Lebensmittelinhaltsstoffe sind die Kohlenhydrate. Bei deren Analytik geht es um die Trennung von Oligo– und Polysacchariden, Zuckern, Zuckeralkoholen, deren Abbauprodukte und Ersatzstoffe (z. B. Zuckeraustausch– oder Süßstoffe). Neben der Lebensmittelbranche ist die Untersuchung von Holz– und Pflanzeninhaltsstoffen ein weiteres großes Anwendungsfeld der Kohlenhydratanalytik.

Die stationären Phasen bei der Analytik von Sacchariden

Für die Analytik von Kohlenhydraten werden meistens polymerbasierte Materialien verwendet, die an der Oberfläche entweder mit Amino– oder Sulfonsäuregruppen (-SO3X) modifiziert sind. Das Gegenion (X) der Sulfonsäuregruppen kann dabei unterschiedlicher Art sein, weil damit die Selektivität der Säule beeinflusst werden kann. Im einfachsten Fall ist dies ein Wasserstoffion (X=H+). Weitere verwendete Gegenionen sind Kalzium (X=Ca2+), Blei (X=Pb2+), Kalium (X=K+) oder Natrium (X=Na+). Mitunter werden auch andere Modifizierungen des Basismaterials für die Trennung von Kohlenhydraten verwendet, z. B. Ammonium-, Carboxyl- oder Diolgruppen.

Beteiligte Trennmechanismen

In Abhängigkeit von der stationären und der mobilen Phase können unterschiedliche Trennmechanismen zum tragen kommen, wobei während einer Trennung oft mindestens zwei davon parallel ablaufen:

  1. Ligandenaustauschchromatographie (LEX) (s. weiter unten)
  2. Größenausschlusschromatographie (SEC)
  3. Ionenaustauschchromatographie (IEX)
  4. Ionenauschlusschromatographie (IEC)
  5. Reversed-Phase-Chromatographie (RPC)
  6. Normal-Phase-Chromatographie (NPC)
  7. Hydrophile-Interaktions-Chromatographie (HILIC)

Der Ligandenaustauschmechanismus

Ein wichtiger Trennmechanismus in der Zuckeranalytik ist die Ligandenaustauschchromatographie (engl.: Ligand Exchange Chromatography, LEX), die im folgendem kurz erklärt wird:

Auf der Oberfläche der stationären Phase sind Sulfonatgruppen gebunden, die nach außen hin mit unterschiedlichen Metallionen neutralisiert sind. Diese Metallsulfonate können mit den Hydroxylgruppen der Zuckermoleküle Komplexe bilden. Diese Komplexe weisen je nach Art und Anzahl der beteiligten Hydroxylgruppen und in Abhängigkeit vom Metallion unterschiedliche Stabilitäten auf. Die zu trennenden Saccharide werden somit verschieden stark von der stationären Phase zurückgehalten und somit zu unterschiedlichen Zeiten eluiert.

In Abbildung 1a sind drei Hydroxylgruppen an der Ausbildung eines Komplexes beteiligt. In Abbildung 1b können aufgrund der räumlichen Anordnung der Hydroxylgruppen im Zuckermolekül nur zwei OH-Gruppen an der Komplexbildung teilnehmen. Somit ist die Wechselwirkung des Zuckermoleküls mit der stationären Phase bei (a) größer als für (b).

Der Ligandenaustauschmechanismus wird oft im Dualmodus mit der Größenausschluss– (SEC) oder der Hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) betrieben. Für die Kombination aus LEX und SEC wird lediglich Wasser als stationäre Phase verwendet; für LEX und HILIC Gemische aus Acetonitril und Wasser.

Die Trennung von Anomeren

Die Trennung von Anomeren

Als Anomere werden bestimmte Diastereomere von Zuckermolekülen bezeichnet, die sich nur am sogenannten "anomeren" Kohlenstoffatom in ihrer Konfiguration unterscheiden. Für Glucose ist dies z. B. α- und β-Glucose (siehe Abbildung). In Lösung können sich diese über offenkettige Strukturen in das jeweilig andere Anomer umwandeln. Dieser Vorgang wird als Mutarotation bezeichnet.  

Anomere können in einigen Fällen via HPLC getrennt werden, bzw. es ergeben sich verbreiterte oder gesplittete Peaks. Dies ist bei der Trennung von unterschiedlichen Zuckern oft nicht erwünscht und soll unterdrückt werden. Um eine Anomerentrennung zu vermeiden gibt es die folgenden zwei Möglichkeiten:      

  • Die Analyse wird bei erhöhten Temperaturen (≥70 °C) durchgeführt
  • Die Analyse wird unter alkalischen Bedingungen durchgeführt

 

Die Analyse von Zuckern bei erhöhten Temperaturen wird meistens mit stationären Phasen durchgeführt, die auf der Oberfläche Sulfonate tragen. Mit Amino-Säulen dagegen kann es vorkommen, dass bereits bei Raumtemperatur keine Anomerentrennung mehr beobachtet wird, bzw. ist eine Temperaturerhöhung auf max. 40 °C notwendig ist, weil durch die schwach basischen Aminogruppen der stationären Phase im Inneren der Säule basische Bedingungen vorliegen.

Detektionsmöglichkeiten bei der Analyse von Sacchariden

Detektionsmöglichkeiten bei der Analyse von Sacchariden

Oft wird bei (Routine)-Analysen von Sacchariden der Brechungsindexdetektor (engl.: refractive index detector, RI-detector) eingesetzt. Dieser ist sehr vielseitig einsetzbar, da die Analyten weder elektrische Leitfähigkeit noch UV-Aktivität aufweisen müssen. Nachteile im Vergleich zu anderen Detektionsmöglichkeiten ist die relativ geringe Empfindlichkeit und Selektivität. Für eine Gradientenelution ist der RI-Detektor ebenfalls nicht geeignet, da sich mit der Änderung der Eluentenzusammensetzung auch der Brechungsindex ändert.

Wenn die Analyten UV- bzw. fluoreszenzaktiv sind, kann ein UV- bzw. Fluoreszenzdetektor verwendet werden. Diese weisen eine hohe Empfindlichkeit und Selektivität auf. Weitere verwendete Detektoren für die Saccharidanalytik sind der ELSD, der CAD oder MS-Detektoren. Diese weisen extrem hohe Empfindlichkeiten und Selektivitäten auf und sind darüber hinaus sehr vielseitig einsetzbar. Nachteil dieser Detektorarten ist der vergleichsweise hohe Preis.

 

Hersteller von Säulen für die Saccharidanalytik

Hersteller von Säulen für die Saccharidanalytik

1. Shodex™

Säulen der HILICpak-Serie: • VC-50 • VN-50 • VG-50 • VT-50
Säulen der SUGAR-Serie: • SC1011 • SC1821 • SP0801 • KS-801 bis KS-807 • SZ5532 • SC1211 • SH1011 • SH1821
Säulen der RSpak-Serie: • DC-613 • KC-811
Säulen der Asahipak-Serie: • NH2P-50 • NH2P-40

2. Concise Separations™

Säulen der CarboSep-Serie: • CHO 411 • CHO 682 • CHO 611 • CHO 611OH •  CHO 620CHO 782  • CHO 882 • CHO 882 FA
CHO 87C FA • CHO 87MM • CHO 820CHO 87C • CHO 87K • CHO 87N • CHO 87P • USP L19
Concise-Separations_Carbohydrate-Analysis-HPLC-Columns.pdf

3. Sepax™

Säulen der Carbomix Serie: • Carbomix H • Carbomix Ca • Carbomix Pb • Carbomix K • Carbomix Na
Sepax_Carbomix-Catalog.pdf
Sepax_Retention-time-Table-for-Carbomix-Phases.pdf

4. Machery Nagel™

Nucleosil® Carbohydrate • Nucleogel® SUGAR-810 • Nucleogel® ION 300 OA • Nucleogel® SUGAR
Machery-Nagel_HPLC-Saeulen-zur-Zuckeranalytik.pdf

5. Mitsubishi Chemical Corporation™

Säulen der MCI Gel™ CK-Serie: • CK08S • CK08E • CK08EC • CK08ES • CK08EH • CK06SC • CK04S • CK04SS • CK02A • CK02AS
Säulen der MCI Gel™ CA-Serie: • CA08F
Säulen der MCI Gel™ CDR-Serie: • CDR10

6. Agilent Technologies™

Säulen der Hi-Plex-Serie: • Hi-Plex Ca • Hi-Plex Pb • Hi-Plex H • Hi-Plex K • Hi-Plex Na

7. Supelco™

Säulen der SUPELCOGEL-Serie: • Supelcogel K • Supelcogel Pb • Supelcogel Ca • Supelcogel C-610H • Supelcogel H • Supelcogel C-611 • Supelcogel Ag1 • Supelcogel Ag2
Säulen der SUPELCOSIL-Serie: • Supelcosil LC-NH2

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