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Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC)

Für sehr polare Analyten, die in der Umkehrphasen-Chromatographie kaum Retention erfahren und in der Normalphasen-Chromatographie aufgrund der starken Wechselwirkungen zur stationären Phase nicht eluiert werden können, kann die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) eine gute Alternative sein. Mit Hilfe der HILIC ist es möglich, in einer der Normalphasen-Chromatographie ähnlichen Art, sehr polare Analyten unter wässrigen Bedingungen voneinander zu trennen.

Grundlagen zur Hydrophilen Interaktionschromatographie

Grundlagen zur Hydrophilen Interaktionschromatographie
Grundlagen zur Hydrophilen Interaktionschromatographie

Stationäre Phasen der Hydrophilen Interaktionschromatographie

Stationäre Phasen der Hydrophilen Interaktionschromatographie

Sowohl Silika-basierte als auch Polymer-Phasen kommen für die Hydrophile Interaktionschromatographie zum Einsatz. Dabei gibt es neutrale, einfach oder mehrfach geladene Phasen.

HILIC-Phasen können in zwei Haupt- und zwei Untergruppen unterteilt werden.

  1. HILIC-Phasen mit keiner/geringer Ionenaustauschkapazität
  2. HILIC-Phasen mit hoher Ionenaustauschkapazität
    • Mit hoher Kationaustauschkapazität
    • Mit hoher Anionaustauschkapazität

HILIC-Phasen mit keiner bzw. geringer Ionenaustauschkapazität (IEX-Kapazität) tragen auf der Oberfläche neutrale Modifizierungen, wie z.B. nicht-acide Hydroxy-, Amid- oder Harnstoff-Gruppen. Solche HILIC-Phasen sind bevorzugt für neutrale oder zwitterionische Analyten geeignet.

HILIC-Phasen mit hoher Kationaustauschkapazität (CX-Kapazität) tragen auf der Oberfläche saure Gruppen, die acide Wasserstoffatome beinhalten, wie z.B. Silanole. Diese zeigen eine erhöhte Retention für basische Analyten.

HILIC-Phasen mit hoher Anionaustauschkapazität (AX-Kapazität) tragen auf der Oberfläche basische Gruppen, wie z.B. Amine. Diese zeigen eine erhöhte Retention für saure Analyten.

 

HILIC-SäulentypIonenaustauschkapazitätOberflächenmodifizierungGeeignet für...
1Keine/geringe IEX-KapazitätNeutralneutrale/zwitterionische Analyten
2Hohe CX-KapazitätSauerbasische Analyten
3Hohe AX-KapazitätBasischsaure Analyten

 

Für die HILIC-Methodenentwicklung ist es ratsam mindestens zwei, besser drei verschiedene HILIC Säulentypen einzusetzen.

Mobile Phase der Hydrophilen Interaktionschromatographie

Mobile Phase der Hydrophilen Interaktionschromatographie

Die mobile Phase enthält immer zu einem bestimmten Prozentsatz Wasser oder wässrigen Puffer. Acetonitril wird meist als organischer Anteil im Eluenten verwendet. Wasser ist dabei das stärker eluierende Lösungsmittel, d. h. der Starteluent (niedrigste Elutionskraft) enthält wenig Wasser (ca. 3 bis 20%). Bei Gradiententrennung wird während der Trennung der Wassergehalt langsam erhöht, wodurch die Analyten nach gegebener Zeit eluiert werden. Isokratische Trennungen sind für HILIC-Trennungen jedoch von Vorteil, da der HILIC-Trennmechanismus eine langsame Kinetik hat und bei Gradiententrennung eine längere Äquilibirierzeit im Vergleich zu RP-Säulen benötigt wird (bis zu 60-faches Säulenvolumen). Die Äquilibrierzeiten hängen maßgeblich von den Startbedingungen des Gradienten ab. Je größer die Unterschiede in der Gradientenzusammensetzung sind, um so länger ist die Äquilibrierzeit.

Der HILIC-Trennmechanismus

Der HILIC-Trennmechanismus

Der Retentionsmechanismus beruht hauptsächlich auf der unterschiedlichen Verteilung der Analyten zwischen einer sehr polaren stationären Phase und einer weniger polaren mobilen Phase. Es besteht somit ein hydrophiles Verteilungsgleichgewicht.

Das im Eluenten vorhandene Wasser bildet an der Oberfläche der stationären Phase eine hydrophile Schicht aus, in der sich polare Analyten bevorzugt aufhalten und somit retardiert werden. Die wasserreiche Schicht der stationären Phase und die Acetonitrilreiche mobile Phase fungieren somit als Flüssig-Flüssig-Verteilungssystem. Weitere Einflüsse auf die Retention haben elektrostatische und Van-der-Waals Wechselwirkungen sowie Wasserstoffbrückenbindungen.  

 

Hersteller von HILIC-Säulen

Mittlerweile bieten eine Vielzahl von Herstellern Säulen für HILIC an, weswegen im Folgendem nur eine Auswahl an Säulen einiger Hersteller aufgeführt wird.

HerstellerNamePorengrößeModifizierungpH-BereichOberflächeHILIC-Säulentyp[3]
ACEHILIC N100 ÅPolyhydroxy2.0–7.0Neutral1
 HILIC A100 ÅSil2.0–7.0Sauer2
 HILIC B100 ÅAminopropyl2.0–7.0Basisch3
GL SciencesInertsil HILIC100 ÅDiol2.0–7.5Neutral1
AMT HaloPenta HILIC[1]90 ÅPentahydroxy2.0–9.0Neutral1
 HILIC[1]90 ÅSil1.0–8.0Sauer2
KromasilHILIC-D60 ÅDiol2.0–8.0Neutral1
ChromanikSunshell HILIC-Amide[1]90 ÅAmide+hydrophilic Group2.0–8.0Neutral1
 Sunshell HILIC-S[1]90 ÅSil1.0–5.0Sauer2
MerckSeQuant® ZIC®-HILIC100 Å, 200 ÅSulfobetaine2.0–8.0Neutral1
 SeQuant® ZIC®-cHILIC100 ÅPhosphorylcholine2.0–8.0Neutral1
 SeQuant® ZIC®-pHILIC100 ÅSulfobetaine2.0–10.0Neutral1
Tosoh BioscienceTSKgel Amide-80100 ÅCarbamoyl2.0–7.5Neutral/Basisch1/3
 TSKgel NH2-100100 ÅAmine2.0–7.5Basisch3
ShodexHILICpak VG-50[2]100 ÅAmino2.0–13.0Basisch3
 HILICpak VT-50[2]100 ÅQuaternary Ammonium2.0–13.0Basisch3
 Asahipak NH2P[2]100 ÅAmino2.0–13.0Basisch3
SepaxPolar-100120 ÅPoly(ethylene glycol)1.5–8.0Neutral1
 Polar-Diol120 ÅDiol1.5–8.0Neutral1
 Polar-Silica120 ÅSil1.5–8.0Sauer2
 Polar-Imidazole120 ÅImidazol1.5–8.0Basisch3
 Polar-Pyridine120 ÅPyridin1.5–8.0Basisch3
Macherey NagelNucleodur HILIC110 ÅSulfobetaine2.0–8.5Neutral1
Osaka-SodaPC HILIC100 ÅPhosphorylcholine3.0–7.5Neutral1
Thermo ScientificSynchronis HILIC100 ÅSulfobetaine2.0–8.0Neutral1
 Accucore Amide-HILIC[1]150 ÅPolyamid2.0–8.0Neutral1
 Accucore HILIC[1]80 ÅSil2.0–8.0Sauer2
 Hypersil Gold Silica175 ÅSil2.0–8.0Sauer2
 Hypersil Gold HILIC175 ÅPolyethyleneimine2.0–8.0Basisch3
SupelcoAscentis Express OH5[1]90 ÅPentahydroxy2.0–9.0Neutral1
 Ascentis Express HILIC[1]90 ÅSil2.0–8.0Sauer2
WatersBEH Amide130 Å, 300 ÅAmide2.0–11.0Neutral1
 Cortecs HILIC90 ÅSil1.0–5.0Sauer2
 BEH HILIC130 ÅSil1.0–9.0Sauer2
WelchUltisil HILIC-Amide120 ÅAmide2.0–8.0Neutral1
  120 ÅSulfobetaine2.0–8.0Neutral1

[1] Fused-Core (Solid-Core) Particles, [2] Base Material: Polyvinylalcohol, [3] Erklärung siehe oben in "Grundlagen zur Hydrophilen Interaktionschromatographie"

Über MZ-Analysentechnik GmbH erhalten Sie Zugriff auf eine Vielzahl von HILIC-Säulen. Gerne erstellen wir Ihnen ein individuelles Angebot zu Ihrer Fragestellung, sodass Sie Preise und Lieferzeiten der einzelnen Hersteller vergleichen können. Über unseren MZ-Onlineshop haben Sie die Möglichkeit HILIC-Säulen auch direkt online zu bestellen.

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