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Chiral

Chirale Chromatographie - Trennung von Enantiomeren

Chirale Chromatographie - Trennung von Enantiomeren

Die chirale Chromatographie ist ein Verfahren um Enantiomerengemische zu trennen. Enantiomere sind Moleküle, bei denen sich Bild und Spiegelbild nicht zur Deckung bringen lassen. Enantiomere unterscheiden sich in ihren Eigenschaften lediglich in der Drehrichtung von linear polarisiertem Licht. In allen anderen chemischen und physikalischen Eigenschaften zeigen sie keinen Unterschied. Aus diesem Grund lassen sich Enantiomere auch nicht mit "konventionellen" HPLC Techniken trennen.

Welche Möglichkeiten gibt es Enantiomere via HPLC zu trennen?

Welche Möglichkeiten gibt es Enantiomere via HPLC zu trennen?

  1. Der mobilen Phase wird "Chiralität zugeführt" - z. B. durch Zusatz eines chiralen Reagens. Dadurch entstehen zwischen den Probemolekülen und den Molekülen des chiralen Reagens diastereomere Komplexe, die unterschiedlich schnell durch die Trennsäule wandern. Die stationäre Phase bleibt dabei unverändert, d.h. sie ist achiral.
     
  2. Die Enantiomere werden reversibel mit einer geeigneten chiralen Verbindung derivatisiert, d. h. chemisch umgesetzt. Dadurch entstehen Diastereomere, die sich auf herkömmlichen HPLC Phasen trennen lassen. Nach erfolgter Trennung werden die Derivate wieder gespalten, wobei darauf zu achten ist, dass unter den Reaktionsbedingungen keine Racemisierung auftritt.
     
  3. Als stationäre Phase wird eine speziell modifizierte, chirale Phase verwendet. Die mobile Phase bleibt unverändert. Die zu trennenden Enantiomere treten unterschiedlich stark mit der chiralen stationären Phase in Wechselwirkung und verlassen somit zu unterschiedlichen Zeiten die Trennsäule.

Die letzte der genannten Möglichkeiten (Nummer 3) wird im Allgemeinen als "chirale HPLC" bezeichnet. Sie ist von den drei Varianten am einfachsten durchzuführen und die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Trennung ist - aufgrund der Vielzahl an erhältlichen stationären Phasen - fast garantiert.

 

Welche stationären Phasen werden für die chirale HPLC verwendet?

Welche stationären Phasen werden für die chirale HPLC verwendet?

Die stationären Phasen für die chirale HPLC (engl.: Chiral Stationary Phases - CSPs) basieren mehrheitlich auf Silica-Gel. Um Enantiomere zu trennen wird dieses mit sogenannten chiralen Selektoren modifiziert. Bis heute wurden eine Vielzahl von solchen Verbindungen entwickelt, wodurch die Auswahl an erhältlichen Phasen enorm groß ist.

Folgende Verbindungsklassen werden hauptsächlich als chirale Selektoren verwendet:

  • Sogenannte "Bürstenphasen" - Einfache chirale Moleküle, die ähnlich der Alkylketten bei der RP-HPLC, auf die Oberfläche des Silica-Gels gebunden sind, z.B. Dinitrobenzoylphenylglycin
  • Helicale Polymere, z. B. Cellulose– oder Amylosederivate
  • Chirale Käfigverbindungen, z. B. Cyclodextrine oder Kronenether
  • Proteine, z. B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Pepsin
  • Ligandenaustauschphasen, z. B. Aminosäure-Kupfer-Komplexe

Am meisten werden modifizierte Cellulose– oder Amylosederivate verwendet, weil mit diesen Phasen im Vergleich zu anderen chiralen Selektoren eine sehr großes Spektrum an Enantiomeren getrennt werden kann.

 

Wie werden die chiralen Selektoren an das Silica-Gel gebunden?

Wie werden die chiralen Selektoren an das Silica-Gel gebunden?

Dafür gibt es mehrere Möglichkeiten. Einige der chiralen Selektoren können kovalent an das Silica-Gel zu gebunden werden. Für manche der chiralen Selektoren ist dies aber nicht möglich. So werden z. B. Polysaccharidderivate in einem speziellen Verfahren entweder an das Silica-Gel chemisch immobilisiert ("Immobilized CSPs") oder darauf beschichtet ("Coated CSPs"). Der Unterschied zwischen den "Immobilized CSPs" und den "Coated CSPs" besteht darin, dass die immobilisierten Phasen gegenüber organischen Lösungsmittel weitaus robuster sind. Für die Coated CSPs sind eine Reihe von Lösungsmitteln nicht erlaubt, da diese die chirale stationäre Phase mit der Zeit unbrauchbar machen. Für die "Immobilized CSPs" ist das nicht der Fall, was die Methodenentwicklung für die Trennung von Enantiomeren vereinfacht.

 

Wo liegen die Anwendungsgebiete für die chirale HPLC?

Wo liegen die Anwendungsgebiete für die chirale HPLC?

Das Hauptanwendungsgebiet liegt in der pharmazeutischen Forschung und Industrie um biologisch aktive Substanzen und Arzneistoffe enantiomerenrein zu gewinnen. Dies ist von außerordentlicher Wichtigkeit, da Enantiomere völlig unterschiedliche pharmakologische Wirkung aufweisen können. Deshalb ist es für die Arzneimittelentwicklung nötig, dass die Zielverbindungen enantiomerenrein vorliegen und getrennt auf ihre Wirksamkeit und Toxizität getestet werden.

 

Welche Hersteller bieten Säulen für die chirale HPLC an?

Welche Hersteller bieten Säulen für die chirale HPLC an?

1. Daicel™ - Chiral Technologies™ ist der führende Hersteller mit der größten Auswahl an chiralen stationären Phasen. Die erhältlichen Partikelgrößen reichen von sub-2 µm für UHPLC Trennungen bis 20 µm für die MPLC. Chirale TLC-Plates für die Dünnschichtchromatographie sind ebenfalls von Daicel™ erhältlich.

Folgende Arten von chiralen stationären Phasen (CSPs) bietet Daicel™ an:         

  • Polysaccharid basierte CSPs (Cellulose– und Amylosederivate, jeweils als Coated– oder Immobilized-Variante erhältlich)
  • Zwitterionische CSPs
  • Protein-basierte CSPs
  • Anionaustausch CSPs
  • Kronenether und Aminosäure-Metall-Komplexe

2. Nouryon™ (zuvor AkzoNobel) - Kromasil® bietet mit CelluCoat™ und AmyCoat™ zwei besonders robuste chirale stationäre Phasen an. Für CelluCoat™ ist der chirale Selektor Cellulosetris-(3,5-dimethylphenylcarbamat); für AmyCoat™ Amylosetris-(3,5-dimethylphenylcarbamat). Die stationären Phasen halten Drücken bis zu 400 bar stand und sind mit vielen organischen Lösungsmitteln kompatibel, ohne dass die Performance der Säulen beeinträchtigt wird. Kromasil® CelluCoat™ bzw. AmyCoat™ sind in Partikelgrößen von 3, 5 oder 10 µm erhältlich, wobei das 10 µm Material auch als Bulk-Material verfügbar ist.

3. Macherey-Nagel™ ist Hersteller von mehreren chiralen stationären Phasen für unterschiedliche Anwendungsbereiche.
Des Weiteren sind chirale TLC-Plates verfügbar.

HPLC-columnChiral Selector
Nucleodex β-OHUnderivatized β-Cyclodextrin
Nucleodex β-PMPermethylated β-Cyclodextrin
Nucleodex α-PMPermethylated α-Cyclodextrin
Nucleocel DeltaCellulosetris-(3,5-dimethylphenylcarbamate)
Resolvosil BSA-7Bovine serum albumin (BSA)
Nucleosil® CHIRAL-1L-Hydroxyproline-Cu2+-complex
Nucleosil® CHIRAL-2N-(3,5-dinitrobenzoyl)-D-phenylglycin
Nucleosil® CHIRAL-3N-(3,5-dinitrobenzoyl)-L-phenylglycin

 

4. Supelco™ (Sigma-Aldrich™) ist Hersteller einiger spezieller HPLC-Säulen für die Enantiomerentrennung, die ürsprünglich von der Firma Astec in Zusammenarbeit mit Prof. D. Armstrong von der "University of Texas at Arlington" entwickelt wurden. Seit 2006 ist Astec Teil von Sigma-Aldrich.

HPLC-columnChiral Selector  HPLC-column Chiral Selector
Astec Chirobiotic® V (100 Å)
Astec Chirobiotic® V2 (200 Å)
Vancomycin Astec Cyclobond® I 2000 DM2,3-O-Dimethyl
β-Cyclodextrin
Astec Chirobiotic® T (100 Å)
Astec Chirobiotic® T2 (200 Å)
Teicoplanin Astec Cyclobond® I 2000 DMP3,5-Dimethylphenyl β-Cyclodextrin 
Astec Chirobiotic® R (100 Å)Ristocetin Astec Cyclobond® I 2000 DNP2,6-Dinitro-4-fluoromethylphenyl β-Cyclodextrin 
Astec Chirobiotic® TAG
(100 Å)
Teicoplanin Aglycone Astec Cyclobond® I 2000 HP-RSPR,S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin
Astec (R,R) P-CAP™
Astec (S,S) P-CAP™
Poly(trans-1,2-cyclohexanediyl-bis-acrylamide) Astec Cyclobond® I 2000 RSPR,S-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin
Astec (R,R) P-CAP™-DP
Astec (S,S) P-CAP™-DP
Poly(trans-1,2-diphenyl-bis-acrylamide) Astec Cyclobond® I 2000 SPS-Hydroxypropyl β-Cyclodextrin 
Astec CLC-L
Astec CLC-D
Amino acid Cu(II)-complexes Astec Cyclobond® II γ-Cyclodextrin
Astec Cyclobond® I 2000β-Cyclodextrin Astec Cyclobond® II ACAcetylated γ-Cyclodextrin
Astec Cyclobond® I 2000 ACAcetylated β-Cyclodextrin Astec Cellulose DMPCellulosetris-(3,5-dimethylphenylcarbamate)

 

Weitere Hersteller von Säulen für die chirale HPLC sind:

Weitere Hersteller von Säulen für die chirale HPLC sind:

ES-Industries™
Produkt-Linien: • ChromegaChiral (10 Polysaccharid-basierte CSPs) • Whelk-O1 • Whelk-O2 • Phenylglycin und Leucin-Phasen

Merck™
Produkt-Linien: • ChiraDex®

Mitsubishi Chemical Corporation™
Produkt-Linien: • MCI Gel™ CRS10W (DLAA) • MCI Gel™ CRS15W (LDAA)

Separation Methods Technologies™ (SMT)
Produkt-Linien: • SMT ChiralSep

Shinwa™
Produkt-Linien: • Ultron ES-OVM • Ultron ES-OVM-C • Ultron ES-PEPSIN • Ultron ES-BSA• Ultron ES-CD • Ultron ES-PhCD

Shodex™
Produkt-Linien: • ORpak CDBS-453 • ORpak CRX-853

Sumika Chemicals Analysis Service Ltd. (SCAS)
Produkt-Linien: • Sumichiral OA series

YMC™
Produkt-Linien: • CHIRAL ART • YMC CHIRAL NEA (R)(S) • YMC CHIRAL CD BR

Über MZ-Analysentechnik GmbH erhalten Sie Zugriff auf eine Vielzahl von Säulen für die chirale HPLC. Gerne erstellen wir Ihnen ein individuelles Angebot zu Ihrer Fragestellung, sodass Sie Preise und Lieferzeiten der einzelnen Hersteller vergleichen können. Haben Sie Fragen oder wünschen Sie Beratung? Kontaktieren Sie uns! Wir helfen Ihnen gern! 

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